Le jeune reporter Joseph Rouletabille, réputé pour avoir démêlé de difficiles énigmes, se rend, en compagnie de son ami l’avocat Sainclair – le narrateur de l’histoire – au château du Glandier pour y éclaircir une agression. Le château appartient au professeur Joseph Stangerson, physicien renommé qui y mène des expériences avec sa fille Mathilde, la victime du crime.

Qui est donc l’agresseur ? Quel est son mobile ? Et surtout comment a-t-il pu s’échapper de la chambre jaune qui était fermée de l’intérieur ?